細胞凋亡實(shí)驗

細胞凋亡實(shí)驗：
人體內的細胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡則是病理性的，到目前為此，人們已經(jīng)知道細胞的死亡起碼有兩種方式，即細胞壞死與細胞凋亡（apoptosis）。 細胞凋亡是指為維持內環(huán)境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡，是細胞的一種基本生物學(xué)現象，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起著(zhù)的作用。凋亡是多基因嚴格控制的過(guò)程。這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等。凋亡過(guò)程的紊亂可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關(guān)系。如腫瘤、自身免疫性疾病等，能夠誘發(fā)細胞凋亡的因素很多，如射線(xiàn)、藥物等。

細胞凋亡與壞死的區別：
壞死是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無(wú)序變化的死亡過(guò)程。表現為細胞 脹大，胞膜破裂，細胞內容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴重的炎癥反應。
凋亡是細胞對環(huán)境的生理性病理性刺激信號，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應答有序變化的死亡過(guò)程。其細胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。

形態(tài)學(xué)變化：
形態(tài)學(xué)觀(guān)察細胞凋亡實(shí)驗的變化是多階段的，往往涉及單個(gè)細胞，即便是一小部分細胞也是非同步發(fā)生的。先出現的是細胞體積縮小，連接消失，與周?chē)募毎撾x，然后是細胞質(zhì)密度增加，線(xiàn)粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細胞色素C到胞漿，核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為約180bp-200bp片段；胞膜有小泡狀形成，膜內側磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，胞膜結構仍然完整，終可將凋亡細胞遺骸分割包裹為幾個(gè)凋亡小體，無(wú)內容物外溢，因此不引起周?chē)难装Y反應，凋亡小體可迅速被周?chē)鷮?zhuān)職或非專(zhuān)職吞噬細胞吞噬。
a，形態(tài)學(xué)
原理：一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜藖?lái)評判細胞凋亡的進(jìn)展情況。 常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI。三種染料與　DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍色熒光。細胞凋亡過(guò)程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。
優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、方便，成本低
缺點(diǎn)：很主觀(guān)，非常依賴(lài)實(shí)驗者的經(jīng)驗
b，DNA含量

原理：細胞凋亡時(shí),核酸內切酶激活,導致DNA 斷裂,這是凋亡的特征性表現,也為FCM 鑒別凋亡細胞奠定了基礎。當細胞用乙醇、TrtionX—100 處理后細胞膜上出現漏洞，小片段DNA 從細胞內釋放出來(lái),使其DNA 含量低于正常細胞的二倍體。用碘化丙啶( PI) 染色后分析,可在二倍體G1峰前出現“亞二倍體"峰，即細胞凋亡峰(APO峰) ,根據APO峰可測出凋亡細胞百分率。
優(yōu)點(diǎn)：該法簡(jiǎn)單易行,可大批定量檢測凋亡標本,亦可同時(shí)分析細胞的細胞周期位置。
缺點(diǎn)：DNA 含量測定在檢測細胞凋亡中的局限性在于其特異性和敏感性均不高。特異性不高是因為APO 峰代表了一組細胞群體，包括凋亡細胞、機械損傷細胞、低DNA 含量的細胞或不同染色體結構的細胞，在上述情況下,DNA 與熒光染料的結合量均小。另外，非固定的細胞在低滲溶液中被溶解時(shí)，可導致大量的核碎片出現，此時(shí)APO 峰的細胞數目只代表了核碎片的數目，并不代表凋亡細胞數目。敏感性較差的原因是細胞凋亡早期只有DNA 斷裂點(diǎn)出現，但尚未出現DNA 片段的大量丟失，所以該法不能檢出早期凋亡細胞和發(fā)生于S 期或G2/ M 期的凋亡細胞，因為其實(shí)際含量不低于二倍體細胞所含的DNA，因此該法進(jìn)行凋亡細胞分析時(shí)應結合其它形態(tài)或生化方法，以期更準確地分析細胞的凋亡狀態(tài)。
c，AnnexinV/PI

原理：PS從細胞膜內側轉移到外側在細胞受到凋亡誘導后不久發(fā)生，可能作為免疫系統的識別標志。AnnexinV，一個(gè)鈣依賴(lài)性的磷脂結合蛋白，能專(zhuān)一性的結合暴露在膜外側的PS，再通過(guò)簡(jiǎn)單的顯色或發(fā)光系統進(jìn)行檢測。由于這是一種凋亡早期的活細胞檢測（懸浮細胞和貼壁細胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結合來(lái)標記凋亡的發(fā)展階段。
優(yōu)點(diǎn)：細胞凋亡時(shí)膜上PS 外露早于DNA 斷裂發(fā)生,因此該法檢測早期凋亡更為靈敏，且該法不需要固定細胞，避免了PI 法因固定造成的細胞碎片過(guò)多及TUNEL法因固定出現的DNA 片段丟失，因此更加省時(shí)，結果亦更可靠，是目前為理想的凋亡定量檢測方法。
缺點(diǎn)：檢測早期凋亡更好，好與其他檢測晚期凋亡的方法結合使用，對檢測試劑、儀器要求較高。
d，線(xiàn)粒體膜電位
原理：在受到凋亡誘導后線(xiàn)粒體轉膜電位會(huì )發(fā)生變化，導致膜穿透性的改變。MitoSensorTM，一個(gè)陽(yáng)離子性的染色劑，對此改變非常敏感，呈現出不同的熒光染色。正常細胞中，它在線(xiàn)粒體中形成聚集體，發(fā)出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中，因線(xiàn)粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細胞液中，發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。

優(yōu)點(diǎn)：采用熒光的檢測方法，放大了凋亡信號，靈敏度高。
缺點(diǎn)：不能區分細胞凋亡或其他原因導致的線(xiàn)粒體膜電位的變化。

e，TUNEL

原理：由于內源性核酸內切酶激活,細胞自身的染色質(zhì)或DNA 被切割，并產(chǎn)生與DNA 斷點(diǎn)數目相同的3’ 羥基末端，TdT 可以將生物素化的dUTP 標記至3’ 羥基末端，通過(guò)卵白素2FITC 系統，使DNA 的斷點(diǎn)部位發(fā)生特異熒光而簽別出凋亡細胞。但由于斷裂DNA 的標記過(guò)程比較復雜，涉及多種因素，所以末端標記的陰性結果并不代表DNA鏈的完整，應排除方法上的問(wèn)題，如TdT 酶活力的喪失等諸多影響因素。因此應用TdT 末端標記法鑒別凋亡細胞同時(shí)設陽(yáng)性及陰性對照組，以便得到可靠結果。
優(yōu)點(diǎn)：TdT末端標記法是鑒別凋亡細胞比較特異的一種方法
缺點(diǎn)：標記過(guò)程比較復雜，涉及多種因素，實(shí)驗成敗受試劑質(zhì)量、操作手法影響較大。

f，Caspase-3/7
原理：Caspase-3是細胞凋亡過(guò)程中主要的終末剪切酶，Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成。Caspase-3主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP(poly(ADP-ribose) polymerase)，該酶與DNA修復、基因完整性監護有關(guān)。在細胞凋亡啟動(dòng)時(shí)，116kD的PARP在A(yíng)sp216-Gly217之間被caspase-3剪切成31kD和85kD兩個(gè)片段，使PARP中與DNA結合的兩個(gè)鋅指結構與羧基端的催化區域分離，不能發(fā)揮正常功能。結果使受PARP負調控影響的Ca2+/Mg2+依賴(lài)性核酸內切酶的活性增高，裂解核小體間的DNA，引起細胞凋亡?？梢酝ㄟ^(guò)Western blot，酶活性檢測，流式細胞術(shù)等技術(shù)檢測Caspase 3/7的活性與表達。
優(yōu)點(diǎn)：Caspase 3/7活性檢測，可檢測的方法學(xué)較廣，靈敏度較高。
缺點(diǎn)：需要和下游PARP的檢測，同時(shí)驗證。

g，PARP

原理：PARP，即poly(ADP-ribose) polymerase，是定位在細胞核內，和應激條件下DNA修復密切相關(guān)的一種酶。PARP在體外可以被多種Caspase剪切，在體內是Caspase 3的主要剪切對象。對于人PARP，在A(yíng)sp124和Gly215之間被Caspase剪切后，使PARP羧基端的催化結構域(89kD)和氨基端的DNA結合結構域(24kD)相分離，從而使PARP失去其酶活力。PARP對于細胞的穩定和存活非常重要，PARP失去酶活力會(huì )加速細胞的不穩定。PARP剪切被認為是細胞凋亡的一個(gè)重要指標，也通常被認為是Caspase 3激活的指標。
優(yōu)點(diǎn)：檢測方法常規可信，凋亡特異性高
缺點(diǎn)：不能檢測凋亡早期

服務(wù)說(shuō)明：
1. 凋亡檢測方法可由客戶(hù)，也可由我們推薦，后由客戶(hù)抉擇；
2. 凋亡實(shí)驗涉及的細胞、藥物，可由客戶(hù)提供，也可查看公司的產(chǎn)品庫，亦可由我們代購；
3. 凋亡實(shí)驗建議選擇2種不同的方法相互驗證。
提交的產(chǎn)品和資料：
實(shí)驗報告

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