單細胞轉錄組測序

單細胞轉錄組測序簡(jiǎn)介：10x Genomics 是基于微流控技術(shù)的單細胞系統，可同時(shí)獲得100-800000個(gè)細胞的表達信息，實(shí)現對細胞群體的劃分與細胞群體間基因表達差異的檢測，是腫瘤細胞異質(zhì)性、免疫細胞群體檢測以及胚胎發(fā)育研究的黃金方法。10xGenomics單細胞應用廣泛，可應用的細胞類(lèi)型有：生殖細胞，胚胎細胞，神經(jīng)細胞，免疫細胞，腫瘤細胞，干細胞，其他原代細胞。

1  單細胞轉錄組測序實(shí)驗流程

1.1實(shí)驗流程圖

1.2實(shí)驗描述

1) 細胞質(zhì)檢RNA，用Countess®II Automated Cell Counter對細胞計數，將細胞濃度調整到理想濃度1×106/mL。

2) 10x 標記cDNA的片段，含有barcode信息的凝膠珠子首先與細胞和酶的混合物結合，然后被位于微流體'雙十字'連接中的油表面活性劑液滴包裹。液滴非常小，僅能容納一個(gè)凝膠珠子，液滴流到儲液器中被收集后，凝膠珠子溶解釋放引物序列，逆轉錄cDNA的片段，并以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴增。將每個(gè)液滴中含有barcode信息的產(chǎn)物混合，構建測序文庫。

3) 建庫，首先利用Biorupter 超聲破碎儀將cDNA 打斷成200~300bp左右的片段，加上測序接頭P5 和測序引物R1 等傳統二代測序的建庫過(guò)程，后進(jìn)行PCR擴增得到DNA 文庫。

4) 簇生成和測序，利用Qubit 儀器對文庫進(jìn)行定量，合格的文庫被放置到cBot中進(jìn)行橋式擴增，生成簇后利用Hiseq 或者M(jìn)iseq測序儀進(jìn)行測序。原理是每個(gè)循環(huán)都加入A，T，G，C 4 種熒光基團標記的dNTP，依據AT、GC 配對，對應的dNTP通過(guò)1DNA 聚合酶結合到模板DNA 鏈上，其他未結合的dNTP被洗脫掉，結合的位置釋放出熒光信號，被計算機捕捉到并進(jìn)行相應轉換，從而得到該位置的堿基信息。