細胞周期檢測服務(wù)

實(shí)驗共分以下4個(gè)主要步驟:

1.細胞鋪盤(pán)

HeLa S3細胞，密度為80%左右分盤(pán)，使鋪盤(pán)密度在50%左右， 為滿(mǎn)足流式細胞儀上機要求，細胞數目需大于1x10組。2.細胞同步化處理:

a)加入終濃度2mM的Thymidine同步化18h

b)用溫育的PBS洗4次，更換新鮮培養基，培養9h

c)再加入2mM Thymidine再次同步化18h后

3.樣品收集;

a)分別收取釋放2h(S期)，6h(G2/M期)和12h(G1期)細胞樣品

b)每個(gè)樣品收取都使用預冷的PBS洗滌4次，1000g離心5min, 棄上清

c) 100uL PBS重懸沉淀，吸取出細胞懸液于移液器中，于移去細胞的管中加入900μl預冷的70%乙醇，旋渦振蕩器震蕩中滴入細胞懸液。

d) 4C固定一小時(shí)或更 長(cháng)時(shí)間。

e) 1500rmp，離心10min,去固定液。

f)細胞染色液配制: 50xRNase A母液: 50xPI母液: PBS=20: 20: 960; RNase A母液濃度1mg/mL，工作濃度20μg/mL; PI母液濃度2.5mg/mL, 工作濃度50μg/mL 。

g)細胞37度染色1h。根據細胞童，加入一定體積的細胞染色液(1~1.5mL) 重懸，使上機時(shí)細胞通過(guò)率為

200~350Cl/s，,染色液不可過(guò)多或過(guò)少，過(guò)多則細胞密度過(guò)低上機速度嚴重不足，過(guò)少則導致細胞粘結。

h) 300目篩網(wǎng)過(guò)濾至流式管中。

4.上機檢測;

流式細胞儀上機檢測，計數50000個(gè)細胞。

5.同步化數據分析

數據使用ModFit軟件分析。