免疫熒光染色實(shí)驗

                免疫熒光染色實(shí)驗
免疫熒光是標記免疫技術(shù)發(fā)展早的一種，它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎上建立起來(lái)的一項技術(shù)，通過(guò)將抗體與一些示蹤物質(zhì)結合，利用抗原抗體反應進(jìn)行組織或細胞內抗原物質(zhì)的定位。

1、細胞固定和通透

為達到佳的檢測效果，細胞需要經(jīng)過(guò)固定和通透。這些步驟非常關(guān)鍵，細胞和抗原需要佳的結構，并利于抗體與抗原結合。通常情況下，需要通過(guò)以下步驟得以實(shí)現：細胞用2%-4%多聚甲醛固定，之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100進(jìn)行通透。前者是比較溫柔的處理，但是對于核內抗原可能無(wú)效，需要用到Triton。使用皂角苷進(jìn)行通透時(shí)，要注意它會(huì )引起細胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每個(gè)抗體孵育環(huán)節都需要進(jìn)行通透。另外，細胞可以用冰甲醇進(jìn)行同時(shí)固定和通透，可以避免去垢劑的使用。

2、抗體特異性

免疫熒光需要用到特異性非常強的抗體，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結果。在大多數情況下，純化抗體的效果很好，但是正確的對照可以幫助定位抗原。使用只有二抗染色的片子作為陰性對照，有利于減少降低背景干擾。

3、合適的抗體稀釋比例

通過(guò)優(yōu)化抗體稀釋比例來(lái)優(yōu)化染色，通常情況下1ug/ml的純化抗體或者1:100-1:1000的抗血清足夠達到特異性染色的結果。但在能低背景染色的前提下，可以通過(guò)增加濃度來(lái)提高信號強度。如果是*次使用該抗體或測定某抗原，強烈建議濃度梯度實(shí)驗。

4、優(yōu)化緩沖液和封閉劑

盡管很多抗原在常見(jiàn)的Buffer如PBS中可以很好的被染色，但是對于某些目的抗原，更換一下含有不同離子的緩沖液，比如鈣、鎂、鉀等，可以帶來(lái)很大程度上的改善。Rockland可提供優(yōu)化過(guò)的IHC用封閉緩沖液，同樣適用于熒光染色實(shí)驗。

5、選擇正確的二抗

如果您需要做免疫實(shí)驗，我們強烈建議您選擇進(jìn)行過(guò)預吸附的二抗進(jìn)行單染實(shí)驗；如果是雙重甚至是多重染色，那么使用預吸附的二抗。同時(shí)，請優(yōu)先選擇來(lái)自同一物種的二抗

免疫熒光染色實(shí)驗客戶(hù)提供

細胞株或細胞爬片。注：細胞爬片不宜太密；細胞固定。組織切片，一抗

公司提供

基本實(shí)驗步驟、藥品、樣品處理、圖片及圖片分析，熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡拍攝

實(shí)驗周期：1-3周