上海Western blot實(shí)驗

上海Western blot實(shí)驗

蛋白印跡，也稱(chēng)Western，Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。蛋白印跡可以參考如下步驟進(jìn)行操作。
1. 蛋白樣品的制備(Protein sample preparation)
    可以選用適當的裂解液，裂解貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對于某些特定的亞細胞組份蛋白，例如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線(xiàn)粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻提取這些亞細胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行蛋白抽提。
2. 電泳

(1) SDS-PAGE凝膠配制

SDS-PAGE凝膠可以參考文獻資料進(jìn)行配制。

(2) 樣品處理

    在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，于100℃或沸水浴中加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。使用濃縮的蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內可以加入更多的蛋白樣品。蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻資料自行配制。

(3) 上樣與電泳

    冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可。為了便于觀(guān)察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，好使用預染蛋白質(zhì)分子量標準。電泳時(shí)通常在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對于標準電泳裝置或類(lèi)似電泳裝置，低電壓可以設置在80-100V，高電壓可設置在120V左右。標準電泳裝置或類(lèi)似電泳裝置，低電壓可以設置在80-100V，高電壓可設置在120V左右。
    采用普通的電泳儀就可以滿(mǎn)足SDS-PAGE電泳的要求。為方便起見(jiàn)，也可整個(gè)SDS-PAGE電泳過(guò)程均采用恒壓的方式，通常把電壓設置在100V，然后設定時(shí)間為90－120分鐘。設置定時(shí)可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過(guò)沖。通常電泳時(shí)溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，或根據預染蛋白質(zhì)分子量標準的電泳情況，預計目的蛋白已經(jīng)被適當分離后即可停止電泳。

上海Western blot實(shí)驗
3. 轉膜(Transfer)
    轉膜時(shí)，具體的轉膜時(shí)間要根據目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時(shí)間越長(cháng)，目的蛋白的分子量越小，需要的轉膜時(shí)間越短。如使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置，轉膜電流可設定為80V/2H or 10V過(guò)一晚。
   在轉膜過(guò)程中，特別是高電流快速轉膜時(shí)，通常會(huì )有非常嚴重的發(fā)熱現象，好把轉膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉膜。轉膜效果可以通過(guò)預染蛋白質(zhì)分子量標準觀(guān)察轉膜效果，通常分子量大的1-2條帶較難全部轉到膜上。轉膜效果也可以用麗春紅染色液對膜進(jìn)行染色，以觀(guān)察實(shí)際的轉膜效果。也可以用考馬斯亮藍染色液對轉膜后的PAGE膠進(jìn)行染色，以觀(guān)察蛋白的殘留情況。

4. 封閉(Blocking) 
    轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的悅延生物WB洗膜液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉膜液。從轉膜完畢起，以后的步驟均要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景?？捎冒退固匚芪M洗滌液，加入WB封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60分鐘。如背景較高，可以在4℃ 封閉過(guò)一晚。在整個(gè)Western過(guò)程中可使用側擺搖床，側向擺動(dòng)速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
    參考文獻，按比例用WB一抗稀釋液適當稀釋一抗。用巴斯特吸管吸盡封閉液，不要漂洗，直接加入稀釋好的一抗，室溫側擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)在再37℃水箱一小時(shí)。如果效果不佳，可以在4℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)一晚?；厥找豢?，加入WB洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。洗凈洗滌液后，再加入WB洗滌液，，漂洗3-6次，每次5-10分鐘。如果結果背景較高可以適當延長(cháng)漂洗時(shí)間并增加漂洗次數。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
    參考文獻，按照適當比例用WB二抗稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標記的二抗。用巴斯特吸管吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)?；厥斩?，加入WB洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。洗凈洗滌液后，再加入洗滌液，漂洗3-5次，每次5-10分鐘。如果顯色結果背景較高，可以適當延長(cháng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數。
7. 蛋白檢測(Detection of proteins)
    檢測結果可使用相應顯色試劑來(lái)檢測蛋白，具體使用細節請參考相關(guān)文獻。.
8. 膜的重復利用(Membrane recovery)
    如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用悅延生物WB抗體去除液處理蛋白膜，以重復利用蛋白膜。
9.您需提供
    需新鮮或正存的蛋白樣品或者蛋白粗提液，陽(yáng)性對照樣品（如果有）， 檢測目的蛋白的一抗（或由悅延生物代購）。組織樣品不少于50mg；細胞不少于5×106個(gè)；總蛋白濃度不低于 2μg/μl（至少50μl）。